巴氏殺菌機的工作原理是將混合原料加熱至68～70℃，并保持此溫度30min以后急速冷卻到4-5℃。因為一般細菌的致死點在溫度68℃、時間30min以下，所以將混合原料經此法處理后，可殺滅其中的致病性細菌及絕大多數非致病性細菌；混合原料加熱后瞬間冷卻，急劇的熱與冷變化也可以促使細菌的死亡。

在一定溫度范圍內，溫度越低，細菌繁殖越慢；溫度越高，繁殖越快（一般微生物生長的適宜溫度為28℃—37℃）。但溫度太高，細菌就會死亡。不同的細菌有不同的最適生長溫度和耐熱、耐冷能力。巴氏消毒其實就是利用病原體不是很耐熱的特點，用適當的溫度和保溫時間處理，將其全部殺滅。但經巴氏消毒后，仍保留了小部分無害或有益、較耐熱的細菌或細菌芽孢，因此巴氏消毒牛奶要在4℃左右的溫度下保存，且只能保存3~10天，最多16天。

當今使用的巴氏殺菌程序種類繁多。“低溫長時間"(LTLT)處理是一個間歇過程，如今只被小型乳品廠用來生產一些奶酪制品。“高溫短時間"(HTST)處理是一個“流動"過程，通常在板式熱交換器中進行，如今被廣泛應用于飲用牛奶的生產。通過該方式獲得的產品不是無菌的，即仍含有微生物，且在儲存和處理的過程中需要冷藏。“快速巴氏殺菌"主要應用于生產酸奶乳制品。國際上通用的巴氏殺菌機高溫消毒法主要有兩種：

一種是將牛奶加熱到62~65℃，保持30分鐘。采用這一方法，可殺死牛奶中各種生長型致病菌，滅菌效率可達97.3%~99.9%，經消毒后殘留的只是部分嗜熱菌及耐熱性菌以及芽孢等，但這些細菌多數是乳酸菌，乳酸菌是有益人體健康的。

另一種方法是將牛奶加熱到75~90℃，保溫15~16s，其殺菌時間更短，工作效率也更高。但殺菌的基本原則是，能將病原菌殺死即可，溫度太高反而會有較多的營養損失。

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